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安捷倫二維液相色譜助力維生素 D 測定第四法

點擊次數:3660  更新時間:2021-05-11

安捷倫二維液相色譜精準助力應對 2020 版藥典 0722 維生素 D 測定第四法

維生素 D 是人體所必須的脂溶性維生素。維生素D的基本作用是能促進鈣和磷的吸收,缺乏維生素 D,會影響鈣的吸收和骨代謝,最終引起佝僂病、軟骨癥或骨質疏松癥等。作為藥物的維生素 D 相關制劑是補充維生素 D 缺乏的最直接的途徑。準確測定維生素 D 及其前體的含量,能夠保證維生素 D 達到目標的效價,從而保證藥物的有效性和安全性。

 

安捷倫二維液相色譜精準助力應對

 2020 版藥典 0722 

維生素 D 測定第四法

2020 版藥典 0722 新增維生素 D 測定第四法相關背景

維生素 D 測定的難點在于含維生素 A 醇及其他相應脂溶性雜質的供試品,如維生素 AD 軟膠囊、滴劑等,其基質中存在大量油性輔料(大豆油)和維生素 A 醇的干擾,同時維生素 D2/D3 含量低(部分品種維生素 D2/D3 含量僅占 1‰ 左右) ,加上維生素 D 易受光熱影響產生前維生素 D(pre-vitamin D)、反式維生素 D (Trans vitamin D)、速甾醇(tachysterol)和光甾醇(lumisterol)等。對于本類樣品,2015 版藥典和 2020 版藥典的第二法和第三法,通常需要將樣品進行皂化、有機溶劑液液萃取,結合反相色譜系統凈化,最后再采用正相色譜系統進行定量檢測。方法測定結果的準確性和重現性較難控制,也嚴重影響方法的分析效率。

 通過二維柱切換的液相色譜技術不僅可以提升系統分離能力,改善結構相似化合物的分離分析;同時可以通過第一維的初步分離去除樣品基質中大量雜質成分干擾,實現樣品凈化。因此 2020 版藥典 0722 維生素 D 測定新增了第四法即在線二維液相色譜法,方法第一維和第二維均采用正相色譜體系,其主要優點是樣品可用正己烷溶解后直接進樣分析,且具有載樣量大,易去除非極性基質干擾成分,同時維生素 D 與其他羥基化的代謝物分離良好等優點。

安捷倫的應對方案

儀器系統的基本搭配如圖 1 所示,整體上需要兩套泵、一個兩位六通切換閥、單或雙紫外檢測器組成。

 

主要色譜條件

色譜柱:

第一維:ChromCore VD-ChP4, 2.1*150mm,3μm(納譜分析,貨號S015-030012-02115S);

第二維:Zorbax Silica, 3.0*100mm, 1.8μm(Agilent Technologies,貨號 828975-301);

流動相:第一維:A: 正己烷;B: 異丙醇; C: 正己烷:正戊醇:異丙醇 (98:1:1); 按下表進行梯度洗脫:

表 1. 第一維流動相梯度

 

第二維:正己烷:正戊醇:異丙醇=996:2:2;等度洗脫。

流速:0.5 mL/min;

柱溫:40℃;

波長:265 nm;

閥切時間窗口:前維生素 D, 保留時間前后各 1.5min;維生素 D,出峰開始前和結束后各 1.5 min;Loop 環體積為 9 mL。

對照品和樣品溶液按照《中國藥典》2020 年版四部通則 0722 維生素 D 測定法第四法要求進行制備。

主要結果

1、對照品分析譜圖

按照藥典采用脲基修飾的 HILIC 色譜柱和正相體系作為第一維分離,結果前維生素 D 和維生素 D 的分離度為 9.8,維生素 D 的理論板數為 7600,*系統適應性測試要求;目標物在第二維分離的峰對稱性良好。

 

2、實際樣品與對照品疊加譜圖

由第一維的樣品分離譜圖可以看出,雖然維生素 D 分離良好,但前維生素 D 由于含量較低,易受到前面大量基質的干擾,通過柱切換方式將該目標組分切至第二維進行分離,能夠對前維生素 D 實現無干擾分離分析。

 

小結

  • 通過二維柱切換法,能夠有效去除樣品基質干擾,改善前維生素 D 的分離,實現對前維生素 D 和維生素 D 的定量分析;

  • 本法對原有標準方法中 35~60min 的清洗過程進行適當調整,嵌入了強洗過程,既利于強保留化合物的快速洗脫(圖 3 中 36-46min 色譜峰),縮減整體分析時間(由 80min 縮減到 65min),加快分析效率,也可避免潛在的強保留物質對后續分析造成影響,使第一維分離更穩定;

  • 由于流動相配制和色譜柱批次間的差異,需要適當調整維生素 D 在第一維色譜柱上的出峰時間在 25min 左右,同時通過對流動相比例的微調,可以使樣品中含量較低且易受基質干擾的前維生素 D 在第二維中分離更好。

 




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